(A)
魚類基因的調控機制，基因表現，啟動子解析及蛋白之生物功能
(a)
斑馬魚肌肉分化的調控蛋白myf-5基因:
Myf-5是在胚胎時期控制肌肉細胞的specification及differentiation的調控蛋白。因此，研究這個蛋白的調控機制及生物特性，不僅在學術上十分重要，而且也可應用來增加魚類肌肉的質及量。多年來，在國科會的支持下在Myf-5的研究完成下列成果:
1)
發現活化myf-5基因上游近端的novel
-82/-62
cis-element
及其trans-factor
Foxd3: 探討魚類myf-5基因的分子結構及胚胎發育時的動態表現;並且利用基因轉殖的方式在in
vivo的條件下微細地解析myf-5基因上游近端重要調控專一性的序列。第一個發現myf-5基因上游的novel
-82/-62 motif是個myf-5之somite-specific
expression的重要序列，並利用yeast
one-hybrid的方法首次發現這個motif是被FoxD3
(以前只知道它是跟神經有關的factor)
transcription factor所結合。因而第一個提出影響肌肉體節發育的機制是經過Pax3-FoxD3-Myf5的途徑模式。
2)
發現intron
I會透過microRNA的機制抑制myf-5表現:在myf-5負向調控方面，第一個發現myf-5的intron
I含有一個新型的會抑制其表現的cis-element存在，其中IE1（+502/+527）、IE2（+816/+835）及中間156
bp的spanning
sequence是關鍵;並獲知抑制作用是orientation-和myf5-specific,進而第一個暸解此intron
1的repression乃是透過microRNA的機制來進行myf5基因表現的負向調控。
3)
定出myf-5基因上游-150
kb會影響myf-5表現的重要cis-elements:以transgenic
lines策略詳細分析myf-5基因上游遠端-150
kb內各cis-element負責調控myf-5表現的角色;並成功地利用BAC
clone技術得到含有上游
-150
kb之myf-5:gfp的轉殖品系，其可以mimic這種somite-specific及stage-dependent的myf-5基因的表現。揭開這個肌肉調控蛋白myf-5基因錯綜複雜的調控機制。
4)
發現myf-5基因參與頭部的發育:第一個證明Myf-5調控蛋白除了負責軀幹體節發育之外，也參與頭部的發育，並獲知Myf-5在頭部肌肉及軟骨發育的功能與Myod完全獨立,不可取代,並提出Myf5及Myod互動的三種可能的調控途徑;開啟了魚類頭部肌肉及軟骨發育的重要領域,將會對人類顏面肌肉及骨骼發育的暸解有所幫助。
5)
發現Myf-5存在於核仁:分析Myf-5之蛋白特性，獲知Myf-5非常特殊地存
在於核仁，與其他三種的myogenic
regulatory factors 如MyoD,Myogenin和MRF4只存在於細胞核並不相同;並瞭解Myf-5
N-端的前23胺基酸是運輸Myf-5到核仁的關鍵序列。
6)
建立好斑馬魚Myf-5調控蛋白的單株抗體。
(b)
斑馬魚肌肉結構蛋白troponin
T基因的解析:troponin是肌肉重要的結構蛋白;有T、C、及I三型；同時又分心臟、慢肌及快肌三種isoforms.
確立斑馬魚troponin
T三種isoforms及troponin
C superfamily的pavalbumin它們的分子結構、演化及在胚胎發育時動態表現。這些成果是將來利用斑馬魚當模式動物研究心臟衰竭或疾病的重要依據。
(c)
鯉魚的視網膜受光蛋白rhodopsin基因的解析:發現鯉魚有2種rhodopsin基因，並利用基因轉殖魚的活體方式詳細解析受光蛋白基因的上游近端控制retinal-specific表現的cis-elements及其可能的tran-factors。
(B)建立心臟帶有GFP之基因轉殖魚作為心臟生物醫學研究
(a) 建立心臟帶有綠螢光之斑馬魚:第一個成功建立整個心臟被綠螢光標誌的轉殖魚穩定遺伝品系(已獲中華民國發明第I
245799號專利;美國專利申請中)。這個轉殖魚將來在心臟病發生的分子機制,心臟病的模式動物及藥物的篩選會有很大的貢獻。
(b)
建立可以conditional
expression外來基因的轉殖魚:
首度在斑馬魚活體上建立一種可以隨時(胚胎、幼魚或成魚)利用doxycycline誘導轉殖進來target基因在心臟專一性表現的tet-on系統。與台大醫院臨床醫學所謝豐舟教授及心臟科何奕倫醫師合作建立第一個斑馬魚類心臟的分子影像、心室收縮功能測定及心跳動圖。
(c)
瞭解魚類心臟再生的機制:與Salk
Institute的Prof.
Belmonte合作發現斑馬魚心臟心室大幅度被切除後會進行修補,而修補的分子機制有一部份是透過心臟發育過程中沒有發生的Notch-Delta
pathway。
(d)
發現更多魚類心臟發育有關的基因及功能:與UCLA的Dr.
Chen合作詳細剖析Na,K-ATPase兩種isoforms
(α1B1及α2)分子結構及胚胎發育時的動態表現;
獲知在心臟早期發育時兩種isoforms獨立的功能。
(e)
魚類心臟在最原始時期跳動的機制:與Caltech的Prof.Gharib合作研究發現早期的心臟管細胞的移動及血流會造成一個為期590ms收縮週期的波動，這個波動開始於靠inflow
tract附近的pacemaker位置；每一個cycle結束前都會造成suction
bolus而吸引血流入心臟管。所以是一種動態性的suction
pump，於是提出了hydro-impedance
pump的
model
(這個model不同於大家過去以為的peristaltic
pump的model)。
(C)建立其他轉殖魚品系作為生物醫學研究及觀賞水族的新材料
除了心臟帶有GFP之基因轉殖魚,蔡教授也建立其他轉殖品系，例如帶有myf-5、rhodopsin、troponin、keratin
18、α-和ß-actin基因大大小小上游序列的DNA片段，能主控開啟tissue-specific的螢光蛋白的報導基因。這些具有特殊遺傳基因品系的轉殖魚可以做為基礎醫學和分子生物學的研究的新材料外,也可以作為研究人類遺傳疾病（眼睛、肌內、皮膚）的途徑。
(a)
眼睛帶有GFP之斑馬魚:與台大眼科楊長豪醫師、亞東醫院胡兆宇醫師合作，利用斑馬魚當材料來研究眼睛的發育及疾病,發現當調控核蛋白Egr1缺乏時會造成眼晴視網膜及水晶体分化不全而出現小眼症microphthalmos。
(b)
卵巢帶有GFP之斑馬魚:第一個成功地建立了只有在卵巢才會有螢光出現的轉殖品系。這個品系可以用來追蹤只在幼魚時才會有雌雄同體特性的斑馬魚，其性別的決定機制及變性的動態研究。以前研究斑馬魚性腺發育必需犧牲個體無法連續觀察到最後性別的決定，因而造成一些動態研究的困難。開發了這個基因轉殖品系就可以解決這個問題。
(c)
皮膚帶有RFP之斑馬魚:成功地尋找到一些skin-specific
gene (例如ictacalcin及keratin
18 ),除了瞭解分子結構、演化及在胚胎發育時動態表現，分析skin-specific
promoter的關鍵序列之外，把它與RFP結合後建立會產生紅螢光表皮的基因轉殖品系。當這些品系之幼魚浸泡含砷的溶液，其皮膚即可輕易見到那一個地方產生tumor
.這個品系勢必有助於將來研究skin
cancer或環境污染的新材料。
(d)
全身性會發螢光的轉殖觀賞魚:利用分子生物科技來改變魚類成特殊遺傳品系，使得這種熱帶魚類有了多樣性的色澤，因而大大地提高該魚種的觀賞價值及國際競爭力(已獲中華民國發明第I
227735號專利)。同時又致力於研究基因轉殖魚之子代變成沒有孕育的能力，避免破壞環境生態。這種全身性可發螢光的觀賞魚品系已成功地推廣至民間企業，使台灣成為世界上第一個能上市這種不會破壞生態環境之水族科技寵物的國家，替國家賺取外匯並提昇國家科技實力及形象。該項成就除國內媒體報導之外，也在國外報章雜誌刊登，並當選Time雜誌2003年最酷發明之一。同時，螢光魚的題材也被列入教科書內，例如Thomson
Brooks/Cole出版的Biotechnology:
An Introduction（2nd
edition,2005）在第8章由Miami大學Susan
Barnum教授主筆的Marine
biotechnology中的「Biotech
Revolution: Fluorescent Fish Pets」就有詳細介紹。還有，我國高職生科教材也放入這個題材。
(D)
研發水產經濟動物（魚、蝦及貝類）之轉殖的新技術
(a) 精子載體法技術研發:大部份的經濟魚類、蝦類及貝類的授精卵及其早期胚胎發育的特性並十分清楚，因而會造成在基因轉殖上的困難。若能利用這些經濟水產動物的精子當作攜帶外來基因片段的載體，許多困難應可迎刃而解，但當時精子載體法尚有許多爭議。蔡教授實驗室成功地找出轉殖條件，建立技術平臺，使得經濟水產類的基因轉殖變得十分簡便且有效。例如轉殖了帶有生長基因而得到了一些成長較快的轉殖品系：泥鰍、九孔、淡水蝦。由於這些研究的成果，使得利用精子載體法轉殖外來基因片段到水產類變得十分確切。最近,又開發九孔轉殖中最簡便、有效的”精巢直接轉殖法”更;這項創新技術己獲World
Aquaculture雜誌特別刊登報導。
(b)
可強表現外來基因的新組合:首度利用AAV-ITR的cassette來降低transgene在轉殖魚親代（FO）會有不均勻表現的缺點，進而增加transgene在germline
transmission的穩定性。這個在斑馬魚基因轉殖研究中是個創新的概念，已被美國Elsevier
Science所出版的Transgenic
Animal Technology：A
Laboratory Handbook（2nd
edition,2002年）在第10章，第261-278頁，由Dr.
Richard Winn主寫的“Production
of Transgenic Fish”中引用。
(E)
開發魚類胚胎活体分子影像技術
近年來與台大電機系光電所孫啟光教授開發魚類胚胎活体分子影像技術,即利用
modified
optical scanning microscope及Cr:forsterite
laser microscope以不用添加任何藥劑處理的非侵入性方式直接觀察斑馬魚胚胎的各組織或器官;甚至於開發到可以觀察神經發育時成的動態變化。這種生物分子影像(Biomolecular
imaging)新技術的研發成功,將成為未來胚胎學研究的利器。
