生物化學基礎  酵 素

The Chemical Nature of Enzyme Catalysis

酵素催化的化學本質

成就酵素催化能力的十條化學原則

台灣大學  微生物與生化學研究所  莊 榮 輝

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酵素催化活性的化學本質  The Chemical Nature of Enzyme Catalysis

本主題討論酵素具有催化活性的基本原理，以蛋白質的分子構造為基礎，深入其化學鍵結與機制。 整個主題的代表性實例，就是研究得非常清楚的 chymotrypsin；請複習這個酵素的催化機制，其重點有： (1) catalytic triad 的形成與催化能力、(2) 順序式催化方式兩個步驟 acylation 與 deacylation 之每一細節、(3) 酵素如何穩定催化過程中的過渡狀態、(4) 酵素如何辨別其特異性基質。 然後檢驗你對此一機制的熟悉程度：請取出一張白紙，用筆逐一畫出上述各點，說明給另一位同學聽，並且相互討論。

          上述的 chymotrypsin 催化過程，在網頁上有動畫，並且有酵素的相關基本資料，也收集有關酵素的純化與分析等說明文字，請隨時上網參考。

          Chymotrypsin 動畫： http://ccms.ntu.edu.tw/~juang/BCbasics/Animation1.htm#Chy

          酵素純化與分析： http://ccms.ntu.edu.tw/~juang/ECX/index.htm

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酵素 的催化能力，可將基質快速轉換成生成物，但酵素本身並無改變。酵素之所以賦有這般能力，完全是靠他的活性區 (active site)，活性區只能與其專一性基質結合，才能有效地催化，並且穩定『過渡狀態』的生成；而每一種酵素的特定分子構形，則是成就此專一性結合與催化的主因。蛋白質的構形非常重要，若構形瓦解則其生理功能喪失；而正確構形之能成形，則決定於所組成之胺基酸序列，後者又是由基因上的核甘酸序列所決定。

          本課程將這些重要觀念整理成十條文字，回顧酵素催化活性在分子層次的化學特性。更詳細的文字，可閱讀指定的教科書章節：Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) Chap. 3，該章複習蛋白質的構造與化學性質，並且說明酵素催化活性的根源。

 (1) 酵素活性區與其基質有專一性結合

 (2) 酵素活性區可降低中間過渡狀態的位能

 (3) 酵素的活性區是一個凹陷口袋並具有特定分子構形

 (4) 酵素的催化機制可歸納成三種基本動作

 (5) 胺基酸側鏈基團的化學特性對蛋白質構形與功能有重大影響

 (6) 蛋白質分子構形的組成有四個層次

 (7) 蛋白質有種種修飾方式以便調節其功能

 (8) 蛋白質的『功能』與其分子構形有關

 (9) 胺基酸序列藏有最終蛋白質功能的大部分信息 (但非全部)

(10) 蛋白質的胺基酸排列是由其基因的核甘酸序列所決

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酵素之催化 始於酵素與基質之結合，這種結合是具有專一性的；也就是說酵素只能與其特定基質結合，然後進行催化反應。但有些自然或化學物質，其構形與酵素基質很像，但酵素與之結合後，卻無法進行反應，這是生物界經常出現的酵素抑制策略。

          這種專一性的結合力，可用化學鍵結來說明，並分成兩種方式 (如下)： 首先，這兩個進行專一性結合的接面，其分子構形應當是互補的，有如鑰匙與鎖頭的組合一般；其次，這兩個接面，有許多微弱的吸引力量互相牽引，都是由各種二級鍵所貢獻。

          例如上面 chymotrypsin 的活性區旁邊，有一個專門辨識基質的大口袋，上面多分布著非極性胺基酸，因此 chymotrypsin 偏好大而非極性的胺基酸側基，專門水解 Tyr, Trp, Phe 等胺基酸位置。

          專一性對生物而言極其重要，想一想在細胞內，還有哪些分子配對是具有專一性結合的？ 你至少還得想出十種如此的配對，例如抗體與抗原。

I. Conformational Match:  Van der Waals interaction

II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der Waals interaction

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在生化反應中 微弱二級鍵的重要性，並不亞於共價鍵；尤其在上述兩分子間的專一性結合上，幾乎都是二級鍵所貢獻，很少是靠共價鍵所形成的。但因為單一個二級鍵實在太弱了，因此必須集合許多二級鍵級，才能有較強的力量，而此種結合是可逆的。

          這種兩分子間的可逆性結合，可用魔鬼氈的例子來說明；魔鬼氈的一面是由很多微小鉤鉤所組成，另一面是許多微小圈圈，一個小鉤與一個小圈互相勾著，所形成的結合力雖然很小，但若數目增多了，就可產生相當的力量，例如可以綁住鞋子而不用鞋帶。魔鬼氈好用的地方是不用綁鞋帶，而且打開也非常方便，用力一撕就可以分開；分子之間的可逆性結合，比較像魔鬼氈的方式，使用許多微弱的二級鍵。 若是用共價鍵，則形成共價鍵需要很多能量，然後打開共價鍵也要花更多能量，通常都要由特定的酵素來催化進行 。

          假如一個細胞內的所有鍵結都是由共價鍵組成，會產生什麼後果？

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酵素 可催化共價鍵的生成或斷裂。 這些涉及共價鍵變化的反應，通常都有一個位能很高的『過渡狀態』；在沒有酵素的存在下，這個位能很難攀上，因此基質 (S) 不太容易自動變成生成物 (P)。當基質與酵素結合後，酵素活性區的構形會誘導基質轉變成過渡狀態，並且穩定此一過渡狀態，然後轉變成生成物。

         以 chymotrypsin 為例，其穩定『過渡狀態』的最主要原因，是因為基質結合區附近的胺基酸，剛好可提供一些稍帶正電的氫原子，中和掉過渡狀態的高密度電荷，因此穩定此過渡狀態，加速反應進行 (見第一條)。 以酵素的催化反應來說，穩定過渡狀態的『接面』是很重要的，那也就是其活性區的主要部份空間。

          你能否想像一下，在遠古的 RNA world 裡，最早的酵素是如何演化出來的？ 然後，蛋白質是如何整合入 RNA world，並且成為主司催化的巨分子？ 另外，順便回答一個問題：除了蛋白質外，RNA 也可以有催化能力，請說明為何。

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酵素 分子為何有催化的能力？ 因為酵素活性區是一個凹陷的口袋，具有一定的分子構形，可以與基質專一性地結合，並且以各種機制誘導『過渡狀態』的生成 (如前述)。此外，這個口袋可以避開環境中的水分子，防止水合作用干擾催化反應。同時，口袋內的一些胺基酸基團可能具有高反應性，直接或間接參與催化；有些則引入輔脢或輔因子，都可以加強催化反應。

          要達致這些效果，有兩個重要因素必須滿足：其一是酵素的構形，另一則為酵素活性區上面的胺基酸特定排列；當然，你可以說構形還是由胺基酸的排列所造成的。 確是如此，但我們還是可以分開來思考，因為兩者的效果有點不同，構形是分子整體的影響，胺基酸序列則可能在某一單點位置上，對催化反應有重要作用。

           抗體與抗原也有專一性的結合，與酵素-基質間的關係很相像；但是抗體僅止於結合抗原，然後誘發免疫生理上的某些反應，例如補體系統。 有無可能把抗體改造成具有催化性的能力？ 請想像一下這種可能性、可能遇到的問題，以及其解決方案。

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催化反應 經過解析與歸納，發現大多酵素都是取用三種基本動作，經過排列與組合後，完成自己特定的催化流程。其中 bond strain 與 orientation 都是以空間上的限制，來完成某些催化動作，顯然是分子構形的貢獻；而 acid-base catalysis 則是化學性的 electrophilic 或 nucleophilic 攻擊反應。另一件值得注意的，是幾乎所有蛋白脢水解反應，都是應用上述的 nucleopholic attack 機制，儼然是一種核心的水解反應模式。

          下半圖模仿 Lehninger Principles of Biochemistry (2000, 3/e) 酵素章節中的一個假想酵素 stickase (棒棒脢)，利用此模型來說明這三個基本動作。棒棒脢應用三個連續的動作，就可以把假想的基質斷裂成兩半。

          你會不會懷疑，千萬種的酵素催化機制，怎麼可能只有三種基本動作？ 但是，若想想所有生命的根本組成，只有四種分子 A, T, C, G，也就不會太奇怪了。

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酸鹼催化 是常見且重要的酵素催化方式。 在上圖的例子中，酵素活性區可提供特定的胺基酸基團 (右邊兩個實心方塊)，同時以 acid 或 base catalysis 加強水分子對 carbonyl 基團的 nucleophilic attack 反應。只有酵素可以利用活性區的胺基酸分布，來組合成如此一推一拉的協同效果，是一般試管中的化學反應所難以達致的技巧。

          你能否以基本的有機化學知識，設計不同的反應機制？。

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胺基酸 的構造與功能性質，有兩個重點：(1) 兩個胺基酸如何脫水產生胜汰鍵，以及胜汰鍵的特性、(2) 二十種胺基酸有不同的側鏈基團，各有獨特的化學性質。因為胺基酸是組成蛋白質的單位，因此二十種側鏈基團的性質，當然對整體蛋白質的最終特性，有著根本的影響。例如，基團的極性或非極性，以及其在蛋白質中的排列位置，就會影響最後整個蛋白質構形的穩定性，以及這個蛋白質的功能與活性。

            胺基酸可大致分成極性及非極性兩大類，極性又有正電、負電及不帶電，每一大類中有各種不同長短的側鏈，共同組成形形色色的積木套組，期以堆疊出各種繽紛的蛋白質分子。整個宇宙看來是一個『組合式』的編織世界，基本粒子組合成質子、中子，再組成原子，原子先組合成各種小分子，其中的單位小分子組合成巨分子，再共同組成細胞，細胞組成組織、器官，然後成為生物個體。經過如此多層次的組合，每一階層的組合結果，都會衍生出新的功能與效應，並且進行下一層次的進一步組合。

           回到胺基酸。你有沒有發現，二十種胺基酸的側鏈基團，其反應性都不是很強，最強的只有酸基、胺基等，連稍具強一點反應能力的醛基都沒有。為什麼演化選擇如此？

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蛋白質構形 是由胺基酸連接起來，然後一級一級堆疊上去，共有四個層次。不過，注意這種四級構造的區分是人為的，胺基酸不會先連成一條長鏈，先繞成 a helix 或 b sheet，接好雙硫鍵後形成三級構造，再組合成四級構造。其實，蛋白質構形的正確摺疊過程，可能遠比我們所能想像的要複雜，幾乎一開始轉譯出一小段胜汰就馬上進行摺疊，其中還需要一些蛋白質的協助，統稱為 chaperone，以及多種轉譯後的修飾。

          然而，由胺基酸組成蛋白質後，原本只是一般化學物質的胺基酸，開始變成具有某種生物『活性』的蛋白質或酵素，有些酵素還知道如何進行其自身活性的調節，已經是接近有『智慧』了；以蛋白質為成份之一，再進一步組合成細胞，則真正具有了生命。因此，胺基酸與蛋白質之間，似乎是『生物』與『無生物』之間的臨界點。

           你認為這個臨界點在哪裡？

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假如 要舉出生命現象所依賴的基本化學形式，相信胜汰鍵可列為其中之一。

           胜汰鍵有一個相當特殊的化學構造，就是胜汰鍵前後總共六個原子，全都落在同一個平面上；因此一條蛋白質長鏈，就好像由一長串的連續平面所組成 (如上圖)。但是蛋白質並不會平攤成一條直線，因為每個胺基酸側鏈的基團性質不同 (見第五條)，各有其立體構造的限制性，使得這種長條胜汰鏈會自動捲曲起來，形成蛋白質的二級構造，主要有 a helix 及 b sheet 兩種，這兩者再堆疊成三級構造，蛋白質就會開始產生其生物活性。 因此，前一頁所述的生物與無生物臨界點，或許可更精確地焦集在胜汰鍵平面。

          由一級構造預測蛋白質的二級構造，相當準確；但截至目前，還沒有真正的解決方案，可以由一級的胺基酸序列，直接預測蛋白質的三級立體構造。

          假如電腦處理能力繼續以摩爾定律倍增，你認為有無可能完成這個挑戰？

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很多蛋白質 在合成出來之後，要再經過修飾，才有完全的活性；這種修飾動作有許多方式，且形成各種調節機制，在生物活性或細胞功能上，佔著極重要角色。而這些修飾的結果，大部分會造成整體蛋白質構形上的改變，因而影響酵素的活性。

          蛋白質裂解及磷酸化早已熟知，最近又因為 ubiquitin-proteasome system，以及信息傳導在生物醫學上的重大進展，使得二者在基礎研究或醫藥應用上，顯得相當蓬勃。反之，其他修飾方式則較難突破，例如 glycosylation 是因為醣分子定性或定量方法的困難，在研究工作上十分不易，但其重要性已漸被體認。至於蛋白質間的交互作用關係，一向都很被重視，在信息傳導的研究上也有相當成果，但在『蛋白質體學』與『生物資訊學』發達之後，更漸成一支重要的研究主流。

          為什麼蛋白質在合成出來後，才要做這些修飾？ 或換個提問方法，為何在演化過程中，不產生一種含有磷酸基團的胺基酸？

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構形 是決定蛋白質『功能』的根本因素。

          蛋白質要維持正確構形，才能與其他大小分子產生專一性的結合，以便進行下一步的催化或功能，達成細胞的生理需求。上面舉了一些例子，說明各種重要蛋白質的功能，沒有一個可以脫離構形的影響。然而，某些蛋白質的『性質』的確與構形無關，例如等電點或分子量，不管蛋白質的構形是否正確，大概都不會變化太多。

          你能否想到任何一種蛋白質的『功能』是與其構形無關的？ 我曾經在各種上課場合提出這個問題，並且懸賞一千元，到目前沒有同學能夠完全拿走一千元；這個懸賞仍然有效，若你想到任何可能的答案，請儘快 e-mail 給我 juang@ntu.edu.tw。

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胺基酸序列 對蛋白質而言，是最重要的基本骨架。

          胺基酸序列除了決定最終的蛋白質構形之外，其自身的排列則像文字一樣，具有某些特定的意義。例如，PEST site 是一小段富含 Pro, Glu, Ser, Thr 的胜汰，含有 PEST 序列的蛋白質很容易被裂解。因此，解讀蛋白質上面的胺基酸序列，可能得知該蛋白質的性質，有點像解讀古石碑上面的古代文字。

          那麼，蛋白質的胺基酸序列是否包含了其功能的全部信息？ 答案相信是否定的。 因為蛋白質在轉譯之後，可能還需要有修飾作用 (第七條)；雖然修飾是發生在指定的胺基酸位置，但必須有其他的酵素配合才能達成；許多細胞功能，也要聯合兩個以上蛋白質的交互作用才會顯現。同時，也不要忘記前面所提的組合式世界，每一階層的組合結果，都會衍生出新的功能與效應；因此從胺基酸序列到蛋白質成形，必定產生了許多無法單由序列來解釋的新功能。

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當然 所有的生物資訊，最後都藏在細胞的核酸之中，胺基酸序列是由 DNA 經過 RNA 所轉譯出來的。當基因體計畫完成之後，Central Dogma 的視野頓時開闊，將其套在全體基因上，轉錄出表現中的全體 RNA 稱為 transcriptome，後者轉譯成全體蛋白質則稱『蛋白質體 proteome』。要注意隨著表現時期、器官與環境的不同，同一基因體可以表現出不同的蛋白質體。

           基因體或蛋白質體的概念，強迫科學家改以巨觀的角度，去考慮整個細胞或生物的表現情形；配合以前針對個別基因或蛋白質的單點深入，可提供研究工作另一完全不同的觀點與思考方式。

           我在一門給非生物科系的通識課程上，宣稱『基因決定生命的一切特質』因而引起軒然大波；許多同學先是震驚，然後表示無法認同 (不一定是宗教理由)，並反問許多問題，例如『那教育何用？ 』 你認為如何？

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整體思考 的結果，使得科學家更勇敢地面對一個細胞的整體代謝通路，以及全體蛋白質分子間的交互結合關係，兩者都可以形成一個很大的關連網路。如此，醞釀出一門新的學科或觀念 - systems biology，注意 system 是複數，因為所探討的生物系統可能不只一個。酵素學當然也被捲入，以全方位的角度去探討整個代謝路徑對細胞活性的影響，以及其所涉及的蛋白質間交互作用，或者信息傳導分子間的上下游關係。

          那麼，酵素學將以何種方式來面對此一發展？ 傳統的酵素純化、活性分析等工具，當然還是重要武器，不過二次元電泳可作為巨觀的探索工具，更全面而快速地去檢定所有蛋白質，精準地挑出有明顯消長的蛋白質，以此投石問路並鎖定目標，再佐以傳統或現代純化分析工具深入探討，必能有所成就。

          但針對如此大量的蛋白質體，如何專一性地去檢測每一個蛋白質，將是關鍵所在。你將如何去面對這個問題？

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回顧 以上酵素催化反應的化學本質，我們依序舉出十條重要現象，說明由基因開始，經轉錄及轉譯生成蛋白質，蛋白質的正確構形賦予其生理活性，活性區因此可與基質產生專一性結合，並有重要胺基酸基團進行催化作用，同時穩定過渡狀態，完成反應。

          這一切都由『序列』開始，然後表現成蛋白質『構形』以達成某『功能』目的：以一次元的胺基酸序列為信息，組合成三次元的蛋白質構形，並產生分子間的專一性與催化機制，來達成生命現象的許多功能。每一種生物體內的每一個酵素都是如此，學習酵素學不可不深刻體認此一精義。

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編輯紀要：

此兩小時的『酵素學』教材，預期能簡要複習生物化學中，有關酵素學的一些基本化學觀念。因此，把大學部課程中，總共約 14 小時的酵素學課程，取出最精要的部份濃縮成 2 小時；同時，上課的推演方式也改用『序列-構形-功能』的骨架，重新以化學的角度來審視原來的酵素催化本質。